ارزیابی فعالیت ضداکسندگی و ضدمی عصاره تخمیر شده برگ گیاه ولیک و نقش آن در پایداری فیزیکوشیمیایی روغن سویا
چکیده
سابقه و هدف: استفاده از آنتی اکسیدان های طبیعی در جهت ممانعت از بروز فساد در روغن همواره مورد توجه متخصصین صنایع غذایی بوده و در این مسیر از گیاهان مختلف که حاوی طیف وسیعی از ترکیبات از جمله ترکیبات فنلی هستند، استفاده شده است. در این پژوهش، فعالیت ضداکسندگی عصاره برگ سبز و تخمیر شده گیاه ولیک و تاثیر آن بر پایداری حرارتی روغن سویا مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش ها: عصاره های متانولی به ترتیب از برگ سبز خشک شده و برگ سیاه شده، تولید گردید. آزمون های مهار رادیکال آزاد DPPH، میزان ترکیبات فنلی، قدرت کی لیت کنندگی و اثر ضدباکتریایی مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافته ها: عصاره برگ سبز ولیک دارای مقدار قابل توجهی از ترکیبات فنلی و متعاقبا خاصیت ضداکسندگی و کی لیت کنندگی بوده و استفاده از آن در روغن سویا، سبب کاهش معنی دار اندیس های اسیدی و پراکسید و افزایش اندیس یدی شد. تخمیر برگ های گیاه منجر به کاهش ظرفیت ضداکسندگی آن شده اما قدرت ضدمی آن را بطور معنی داری افزایش داد.
نتیجه گیری: ظرفیت ضداکسندگی و ضدمی برگ گیاه ولیک قابل توجه بوده و تخمیر آن از یک سو منجر به کاهش قدرت ضداکسندگی و متقابلا افزایش ظرفیت ضدمی اش می شود. به نظر می رسد می توان از برگ ولیک بعنوان منبع ترکیبات فنلی و یک آنتی اکسیدان طبیعی در محصولات غذایی استفاده کرد.
واژگان کلیدی: برگ ولیک، فعالیت ضداکسندگی، فعالیت ضدمی، ترکیبات فنلی، تخمیر
مقدمه
حساسیت روغن ها به اکسیداسیون سبب شده است این ترکیبات در کنار ویژگی های عملکردی منحصر به فردشان، به ابزاری برای تهدید سلامتی انسان مبدل گردند. تحقیقات مختلف نشان داده است درصورت عدم کنترل پارامترهای موثر بر فرآیند نظير نور، يون هاي في، اكسيژن، دما و آنزيم ها، ترکیبات تولید شده در اثر اکسیداسیون، ریسک ابتلا به بیماری هایی همچون سرطان، قلبی-عروقی، تصلب شرایین و فرآیند پیری را به طور معنی داری افزایش می دهد (1, 2). از اینرو محققین همواره به دنبال یافتن راه های موثر در جهت جلوگیری یا کاهش اکسیداسیون لیپیدها بوده اند. در این راستا، استفاده از آنتی اکسیدان های طبیعی و یا طراحی فرمولاسیون مواد غذایی به گونه ای که خاصیت ضداکسندگی آن مدنظر باشد بسیار مورد توجه قرارگرفته است. آنتي اكسيدان ها به منظور افزايش زمان ماندگاري، حفظ ايمني و كيفيت تغذيه اي، خواص عملكردي و مطلوبيت فراورده، در انواع روغن به كار گرفته مي شوند (3). در كنار نقش آن ها در سامانه هاي زيستي، در مواد غذايي سرشار از چربي هاي غير اشباع نيز از كاهش كيفيت تغذيه اي، ايمني، بدطعمي و بي رنگ شدن به علت ايجاد تركيبات سمي جلوگيري مي كنند. فنول ها از دسته ترکیبات گیاهی هستند که بواسطه ویژگی های ذاتی ضداکسندگی، به عنوان ترکیباتی موثر در به تاخیر انداختن فرآیند اکسیداسیون عمل می نمایند. از سوی دیگر ثابت شده است که منشا بسیاری از مواد دارویی و درمانی به دلیل متابولیسم ثانویه گیاهان از جمله ترکیبات فنلی است (2, 4-6).
ولیک (Crataegus elbursensis) یک گیاه دارویی سنتی است و سالیان طولانی به واسطه ویژگی های منحصر بفردش از جمله اثرات سلامتی بخشی و سمیت پایین مورد توجه محققین بوده است (7). اثرات دارویی این گیاه عمدتا مربوط به ترکیبات پلی فنلی و پروسیانیدین های الیگومری موجود در آن می باشد. ترکیبات فعال ولیک و تاثیرات ضداکسندگی آنها توسط بسیاری از محققین مورد ارزیابی قرار گرفته است (7-11). سیاه ولیک فراوانترین گونه ولیک بومی ایران بوده که به فراوانی در جنگل های نواحی شمال کشور یافت می شود. دارای بودن ترکیباتی همچون اسیدهای فنولی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین ها سبب شده است از این گیاه به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی در فرآیند های مختلف غذایی و همچنین در جهت درمان بیماریهای قلبی- عروقی استفاده شود. برگ های گیاه ولیک دارای پلی فنل های مختلف بوده و در طب سنتی چینی به وفور برای درمان استاز خون، درد قفسه سینه، تپش قلب، از دست دادن حافظه، سرگیجه و وز وز گوش استفاده می شود (12-14). پلی فنل های موجود در برگ این گیاه شامل ویتکسین-4-O- گلوکوزید[1] (VG)، ویتکسین-2-O- رامنوزید[2] (VR)، ویتکسین[3] (VIT)، روتین[4] (RUT) و هیپروسید[5] (HP) می باشد (15).
نظر به ویژگی های برشمرده شده برای برگ های این گیاه و همچنین بومی بودن آن، بررسی و اندازه گیری ترکیبات فنولی، ارزیابی فعالیت ضداکسندگی، اندازه گیری قدرت کی لیت کنندگی و اثر ضد باکتریایی عصاره برگ سبز و تخمیر شده ی ولیک مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین، غلظت های مختلف از هردونوع عصاره برگ سبز و تخمیر شده به روغن سویا اضافه شده و شاخص های کیفی شامل اسیدیته، عدد پراکسید و عدد یدی اندازه گیری شد.
مواد و روش‌ها
معرف فنلی فولین-سیوکالتیو[6] (ساخت شرکت مرک[7]، آلمان)، متانول، اسید گالیک[8] 98 درصد (ساخت شرکت فلوکا[9]، اسپانیا)، کربنات سدیم 98 درصد بدون آب[10] و فروس سولفات هپتا هیدرات[11] 98 درصد (ساخت شرکت آکروس ارگانیکس[12]، آمریکا) ، 1-1 دی فنیل-2- پیکریل هیدرازیل[13] و معرف فروزین[14] حاوی 3-(2- پیریدیل) 5، 6 دی فنیل- 1، 2 ،4 تریازین-p، p΄ دی سولفونیک اسید هیدرات مونو سدیم[15] نود درصد (ساخت شرکت سیگما آلدریچ[16]، آمریکا) مورد استفاده واقع شد.
برگ‌های درخت سیاه ولیک در ماه شهریور از باغ‌های شهر گرگان (طول جغرافیایی E ˝29, 54، و عرض جغرافیایی N ˝50, 36، با ارتفاع از سطح دریای 100 متر) چیده، جمع آوری و شسته شدند. برای تهیه برگ‌های سبز خشک، برگ‌های تمیز شده در دمای60 درجه سانتی گراد بالا به مدت 12 ساعت در آون قرار گرفته پس از خشک شدن به قطعات 5/0 سانتی متر مربع خرد گردیدند. برای تهیۀ برگ‌های خشک سیاه، برگ‌های سبز تازه و تمیز را ابتدا در دمای 40 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت پلاسیده نموده سپس عمل مالش دهی و خرد کردن انجام گردید. برای انجام واکنش‌های قهوه‌ای شدن آنها به مدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد گذاشته شده تا زمانی که واکنش‌ها کامل گردد. سپس استفاده از دمای 60 درجه سانتی گراد طی 12 ساعت صورت پذیرفت. برای تهیه عصارۀ متانولی برگ‌ها، 40 گرم از برگ‌های خشک شده با 200 میلی لیتر متانول مخلوط گردیده و به مدت 10 ساعت به حالت س ماند. سپس عصاره‌ها با استفاده از کاغذ صافی واتمن شمارۀ 2 صاف شده و با دستگاه آون تحت خلاء در دمای 50 درجه سانتی گراد بالا و فشار 50 میلی‌بار تغلیظ و خشک گردید. پودر عصاره‌های تهیه شده در دمای 20- درجه سانتی گراد تا زمان انجام آزمایش‌ها نگهداری گردیدند (16).
اندازه گیری فعالیت ضداکسندگی بر اساس مهار رادیکال‌های [17]DPPH
در این آزمون غلظت‌های 25، 40، 50، 75، 100، 150، 250، 300 و 500 میکروگرم بر میلی لیتر از پودر عصاره‌های برگ در حلال متانول تهیه گردید. سپس 3/0 میلی لیتر از هر کدام از پودر عصاره‌ها را با 7/2 میلی لیتر محلول رادیکال‌های DPPH (تهیه شده در غلظتM 3-10×6) مخلوط گردید. مخلوط ایجاد شده شدیداً هم زده و به مدت 30 دقیقه ساکن ماند. میزان جذب نوری آن در طول موج 517 نانومتر با دستگاه طیف نور سنج خوانده شد. نتایج بر حسب درصد رنگبری ترکیب DPPH بر اساس رابطۀ زیر محاسبه و گزارش گردید (17):
Ao/ 100× (Ao– Ac) = فعالیت ممانعت کنندگی(درصد)
که Ao = میزان جذب نوری در نمونۀ شاهد و Ac = میزان جذب نوری در نمونۀ اصلی می باشد.
اندازه گیری میزان کل ترکیبات فنولی
300 میکرو‌لیتر از نمونه‌ها با غلظت 200 میکروگرم بر میلی لیتر در لولۀ آزمایش ریخته و به آن 5/1 میلی لیتر معرف فولین سیوکالتیو (از محلول 10 برابر رقیق شدۀ آن برداشته شد) اضافه شد. سپس 2 میلی لیتر محلول (وزنی/ حجمی) 5/7 درصد کربنات سدیم به آن اضافه گردید. محلول ایجاد شده به مدت 30 دقیقه ساکن گذاشته شده سپس میزان جذب نوری آن در طول موج 765 نانومتر خوانده شد. با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمده با محلول‌های حاوی غلظت‌های صفر، 50، 100، 150، 200 و 250 میلی‌گرم در لیتر اسید گالیک، میزان کل ترکیبات فنولی بر حسب معادل میلی گرم گالیک اسید در گرم عصاره خشک شده گزارش شد. منحنی استاندارد به صورت رابطه (9998/0(R2=148 0/0- x111/0=y است که y میزان جذب نور توسط محلول بوده و x محتوی کل فنولی بر حسب معادل میلی گرم گالیک اسید ([]GAE) در گرم عصاره خشک است (16).
اندازه گیری قدرت کی لیت کنندگی[19] یون‌های آهن دو ظرفیتی
در ابتدا تهیه غلظت‌های 50، 75، 100، 150، 250، 300، 500، 1000 و 2000 میکرو گرم بر میلی لیتر از پودر عصاره‌های برگی سیب با حلال متانول انجام گردید. همچنین محلول‌های mM2 سولفات آهن (FeSo4) و mM5 معرف فروزین نیز تهیه شد. سپس 1 میلی لیتر از محلول 20 برابر رقیق شدۀ سولفات آهن با 1 میلی لیتر از محلول نمونه مخلوط شده و بعد 1 میلی لیتر از محلول 20 برابر رقیق شدۀ معرف فروزین به آن اضافه گردید. به مخلوط به مدت 10 دقیقه استراحت داده و میزان جذب نوری آن در طول موج 562 نانومتر خوانده شد. نمونۀ شاهد فاقد عصاره نیز مورد آزمون قرار گرفت. نتایج این آزمون بر حسب درصد قدرت کی لیت کنندگی بر اساس رابطۀ زیر گزارش شد.
= قدرت کی لیت کنندگی(درصد) Acontrol /100× (Acontrol – Asample)
Acontrol : میزان جذب نوری در نمونۀ شاهد بوده و Asample : میزان جذب نوری در نمونۀ حاوی عصاره میباشد().
اثر ضد باکتریایی
6 گونه باكتري اشريشيا كلی[20](PTCC 1399)، سالمونلا تيفی موريوم[21](PTCC 1596)، شيگلا ديسانتری[22] (PTCC 18)، استافيلوكوكوس اورئوس[23](PTCC 1436)، یرسینیا انتروکولیتیکا[24] و انتروكوكوس فكاليس[25] مقاوم به وانكومايسين (Van R 1) ازسازمان پژوهش‌هاي علمي و صنعتي ايران تهيه شدند. از كشت 24 ساعته باكتري‌هاي مورد نظر در محيط كشت مولرهينتون آگار، يك لوپ به محيط كشت مايع انتقال داده و سوسپانسيوني از باكتري معادل 5/0 مك فارلند تهيه گرديد و طبق روش چاهك (19) از سوسپانسيون ميكروبی معادل نيم مك فارلند برسطح محيط كشت مولرهينتون آگار به صورت يكنواخت كشت داده شد. سپس با استفاده از چوب پنبه سوراخ كن چاهك‌هايی با قطر 7 ميلیمتر ایجاد شد و 100 ميكروليتر از غلظت‌های مختلف عصاره‌ها (110-75/13 میلی گرم بر میلی لیتر) در چاهك‌ها ريخته شد، سپس به مدت 24 ساعت در37 درجه سانتی‌گراد در گرمخانه گذاشته شدند. پس از اين مدت با اندازه گيری قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهك‌ها حساسيت يا مقاومت باكتری‌‌های مورد نظر به عصاره‌ها تعيين شد.
اندازه گیری میزان اسیدیته، عدد پراکسید و عدد یدی
به منظور بررسی پایداری روغن سویای حاوی عصاره، غنی سازی روغن سویا با عصاره‌های برگی صورت گرفت. بدین منظور از پودر عصاره‌های برگی سبز و سیاه درخت سیب، 3 غلظت 500، 750 و 1000 پی‌پی‌ام به روغن سویا تصفیه شده فاقد ضداکسنده تجارتی (شرکت عالیا گلستان) اضافه شد. به همراه نمونه‌های حاوی عصاره‌های گیاهی، نمونۀ تجاری حاوی ضداکسنده تجارتی پروپیل گالات به غلظت 200 پی‌پی‌ام و نمونۀ شاهد فاقد ضداکسنده تولید شده در همان روز (شرکت عالیا گلستان) نیز مورد بررسی قرار گرفتند. این نمونه ها در دمایC 60 به مدت 1 ماه قرار گرفتند تا بعداً از نظر آزمون های تغییرات کیفی از قبیل درصد اسیدیته (20) ، عدد پراکسید(21)، عدد یدی (روش ید هانوس) (22) مورد بررسی قرار گیرند.
تجزيه و تحليل آماري
اين تحقيق به صورت آزمايش مقایسه میانگین‌ها در قالب طرح كاملا تصادفي در 3 تكرار انجام شد و داده‌ها توسط نرم افزار SASآناليز و ميانگين‌ها در سطح 05/0 مقايسه و در نهايت شکل ها با استفاده از نرم افزار Excelرسم شدند.
نتایج
میزان ترکیبات فنلی
روش فولین -سیوکالتیو یکی از متداولترین روش هاي اندازه گیري ترکیبات فنلی است که میزان این ترکیبات را بر مبنای روش طیف سنجی برآورد می نماید. ترکیبات فنلی با احیاي معرف فولین در محیط قلیایی سبب ایجاد کمپلکسی آبی رنگ می شوند که در طول موج 765 نانومتر از خود پیک نشان می دهد. میزان کل ترکیبات فنلی استخراج شده از برگ گیاه بر اساس معادله ي خط منحنی استاندارد گالیک (y=0.111X-0.0148, R2=0.9998) اسید محاسبه شده و در جدول 1 نشان داده شده است.
جدول 1. میزان ترکیبات فنلی و راندمان استخراج در عصاره برگ سبز و تخمیر شده ولیک
نمونه
فنل کل (mg GAE/100 g)
راندمان استخراج
عصاره برگ سبز
a57/0 ±141
a50/0±5/5
عصاره تخمیر شده
b50/0±64
b38/0±4
آزمون مهار رادیکالهاي آزاد DPPH
نتایج مربوط به ارزیابی قدرت مهار رادیکال آزاد DPPH در شکل 1 نشان داده شده است. همانطور که مشخص است در مورد عصاره برگ سبز، با افزایش غلظت عصاره تا 75 پی‌پی‌ام، درصد مهار رادیکال آزاد به طور معنی داری افزایش پیدا کرده (P˂0.05) اما با افزایش غلظت از 75 تا 1000 پی‌پی‌ام، تغییر معنی داری در این روند مشاهده نشد. در خصوص عصاره تخمیر شده، ابتدا باید اشاره نمود فرآیند تخمیر سبب از بین رفتن توانایی مهار رادیکال آزاد تا غلظت 50 پی‌پی‌ام شده و پس از آن، با افزایش غلظت از 75 تا 1000 پی‌پی‌ام، درصد مهار رادیکال آزاد به طو رمعنی داری افزایش پیدا کرد (P˂0.05). از طرف دیگر، توانایی عصاره برگ سبز در مهار رادیکال آزاد در تمام غلظت ها، به طور معنی داری بالاتر از عصاره تخمیر شده بود (P˂0.05) بطوریکه عصاره برگ سبز توانست تا 4/96% و عصاره تخمیر شده تا 5/73% از رادیکال های آزاد را مهار نماید. بنابراین می توان گفت غلظت موثر از عصاره برگ سبز برای رسیدن به حداکثر درصد مهار رادیکال آزاد DPPH، 75 پی‌پی‌ام و برای عصاره تخمیر شده 1000 پی‌پی‌ام بوده است.
[1] - Vitexin-4″-O-glucoside
[2] - Vitexin-2″-O-rhamnoside
[3] - Vitexin
[4] - Rutin
[5] - Hyperoside
[6]- Folin–Ciocalteu’s phenol reagent
[7]- Merck
[8] - Gallic acid
[9]- Fluka
[10] - Anhydrous sodium carbonate
[11] - Ferrous sulphate hepta-hydrate
[12] - Acros Organics
[13] - 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl
[14] - Ferrozine iron reagent
[15] (3-(2- Pyridyl) -5,6 – diphenyl- 1,2,4- triazine- p,p΄- disulfonic acid hydrat monosodium
[16] Sigma-Aldrich
[17] Diphenyl-1-picrylhydrazyl-2, 2
[] Gallic Acid Equivalent
[19] Chelating
[20] Escherichia coli
[21] Salmonella typhimurium
[22] Shigella dysenteria
[23] Staphylococcus aureus
[24] Yercinia enthrocolitica
[25] Entherococcus faecalis مقدمه ای بر اکسید گرافن (GO)
تولید اکسید گرافن با روش هامرز بهبودیافته
واگذاری مقاله ISI- نفر اول یا دوم-صنایع غذایی
برگ ,های ,عصاره ,ترکیبات ,، ,میزان ,میلی لیتر ,به مدت ,تخمیر شده ,عصاره برگ ,برگ سبز ,شرکت عالیا گلستان ,آنتی اکسیدان طبیعی ,ضدمی عصاره تخمیر ,ارزیابی فعالیت ضداکسندگی
درباره این سایت